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细胞膜/细胞浆蛋白抽提试剂盒用于快速便捷分离细胞/组织细胞膜和细胞浆蛋白，抽提的膜蛋白不仅包括质膜上的蛋白，也包括线粒体膜、内质网膜以及高尔基体膜等上的膜蛋白。主要工作原理：通过匀浆适度破碎细胞，经低速离心去除细胞核和少数未破碎的细胞产生的沉淀，随后取上清高速离心获得细胞膜沉淀和含有细胞浆蛋白的上清，然后通过优化的膜蛋白抽提试剂从沉淀中抽提获取膜蛋白。整个过程仅需约90min即可完成，抽提得到的蛋白可以用于SDS-PAGE，Western、酶活性测定等后续实验。

膜蛋白抽提试剂中含有蛋白酶抑制剂、磷酸酯酶抑制剂和EDTA等，后续不适合用于蛋白酶、磷酸酯酶等受这些抑制剂影响的酶的活性测定，但抽提获得的膜蛋白或细胞浆蛋白适合用于检测蛋白的磷酸化水平。

• 客户需自备PMSF，PMSF需现配现用，建议在抽提试剂加入到样品前2～3min加入，以防失效。
  
• 利用本试剂盒抽提到的细胞膜/细胞浆蛋白可直接用BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)（bjbalb Cat#20201）测定其浓度，但不适合用Bradford法测定。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 样品准备
  • 细胞样品
    • 细胞收集
      ① 贴壁细胞：培养细胞约2～5×10⁷个，PBS清洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
      注：尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。
      ② 悬浮细胞：培养细胞约2～5×10⁷个，离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。
    • 细胞清洗
      用适量冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞4℃，600g离心5min沉淀细胞。弃上清，随后4℃，600g离心1min，以沉淀离心管管壁上的残留液体并进一步沉淀细胞，尽最大努力吸尽残留液体。
      
    • 细胞预处理：把1mL试剂A（含PMSF）加入至上述细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置10～15min。
  • 组织样品
    取约100mg组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1mL试剂A（含PMSF），轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10～15min。
    注：如果组织样品比较少，也可以使用更少的组织量，例如30～50mg，后续试剂的用量及操作步骤不变；组织用量较少时，最后获得的膜蛋白也较少。
• 样品的破碎及破碎效果的鉴定
  • 样品匀浆：把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30～50下。
    注：匀浆效果与细胞类型和组织类型相关，不同细胞或组织所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。
    
  • 通常在匀浆30次后取约2～3μL匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环（A shiny ring around the nuclei）或完整的细胞形态，说明细胞仍完整。如果有70～80%的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎，则进行下一步实验。否则，重新匀浆10～30次直到细胞至少70%已经破碎。同时记录对于该细胞的匀浆次数，通常在后续实验时不必再摸索匀浆次数。另外需注意特定的匀浆次数和匀浆器也有关，需同时注意记录使用的是哪一个匀浆器。
    注：如果没有适当的玻璃匀浆器，对于培养的细胞也可以采用反复冻融法来破碎细胞。把样品在液氮和室温依次反复冻融两次，然后取少量样品在显微镜下检测细胞破碎的程度。如果细胞破碎的程度不足70%，可增加冻融次数，直到细胞破碎的程度大于70%。
• 去除细胞核和未破碎的细胞
  4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中。
  注：吸取上清时切勿接触沉淀！可以有约30～50μL上清液残留不予吸取，以保证吸取的上清液有较高的纯度。
  
• 沉淀细胞膜碎片
  4℃，14000g离心30min，以沉淀细胞膜碎片。
  
• 收集细胞浆蛋白
  吸取上清至1新的离心管中，即为细胞浆蛋白，可-70℃保存备用。吸取上清时可以有30～50μL上清残留，以避免接触沉淀导致上清样品被污染。
  
• 抽提膜蛋白
  4℃，14000g离心10 s，尽最大努力吸尽上清。可以轻轻触碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入试剂B 200μL（如有必要，也可加大到300μL），最高速剧烈Vortex 5 s重悬沉淀，冰浴5～10min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1～2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5min，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。可-70℃保存备用。对于一些有特殊用途的膜蛋白，可自行配制适当的膜蛋白抽提试剂进行膜蛋白抽提。